आनुवंशिक अध्ययनहरू सञ्चालन गर्ने प्रक्रियामा, हामीले प्रायः अपर्याप्त आरएनए नमूनाहरू सामना गर्छौं, उदाहरणका लागि, सानो शारीरिक मौखिक ट्युमरहरू, एकल-कोशिका नमूनाहरू, र मानव कोशिकाहरूमा धेरै कम स्तरहरूमा ट्रान्सक्रिप्ट गरिएका विशिष्ट जीन उत्परिवर्तनका नमूनाहरू अध्ययन गर्नका लागि।अवश्य पनि, कोभिड–१९ परीक्षणका लागि स्वाब सही स्थानमा नभएको वा नमूना लिने क्रममा पर्याप्त मात्रामा नआएमा नमूनाको आकार निकै कम हुने भएकाले स्वास्थ्य तथा परिवार नियोजन आयोगले दुई दिनअघि सार्वजनिक गरेको हो । परीक्षण पास भयो, र यदि न्यूक्लिक एसिड नमूनाले छवटा नमूनाहरू लिएन भने, तपाइँ यसलाई रिपोर्ट गर्न सक्नुहुन्छ।
अभिकर्मकको संवेदनशीलता महत्त्वपूर्ण छ किनभने हामीसँग यो समस्या वा त्यो समस्या छ, त्यसैले हामीले RT-PCR को संवेदनशीलता सुधार गर्न के गर्न सक्छौं?
हामीले सम्भावित समाधानहरू छलफल गर्नु अघि, हामीले भर्खरै उल्लेख गरेको अवस्थासँग दुई ठूला जटिलताहरू उल्लेख गरौं।
सबै भन्दा पहिले, हामी आरएनए नोक्सानको बारेमा चिन्तित हुन्छौं जब हामीसँग हाम्रो नमूनामा केही सेल जनसंख्याहरू हुन्छन्।यदि परम्परागत विभाजन र सफाई विधिहरू प्रयोग गरिन्छ, जस्तै स्तम्भ विधि वा न्यूक्लिक एसिड वर्षा विधि, त्यहाँ केही नमूनाहरू हराउने उच्च सम्भावना छ।एउटा समाधान भनेको वाहक अणुहरू थप्नु हो, जस्तै tRNA, तर त्यसो भए पनि, हाम्रो रिकभरी प्रयोग ठीक छ भन्ने कुनै ग्यारेन्टी छैन।
त्यसोभए राम्रो तरिका के हो?संवर्धित कक्षहरू वा माइक्रोएनाटोमिकल नमूनाहरूको लागि एक राम्रो विकल्प प्रत्यक्ष lysis प्रयोग गर्न हो।
कोषहरूलाई ५ मिनेटसम्म विभाजन गर्ने, आरएनएलाई सोलुसनमा छोड्ने, त्यसपछि २ मिनेटको लागि प्रतिक्रियालाई रोक्ने, त्यसपछि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियामा सिधै लाइसेट थप्ने ताकि कुनै पनि आरएनए हराउन नपरोस्, र अन्तमा नतिजा सीडीएनएलाई सीधै राख्नुहोस्। वास्तविक समय प्रतिक्रिया मा।
तर के हुन्छ यदि, सीमित सुरूवात बिन्दु वा लक्ष्य जीन अभिव्यक्तिको सानो मात्राको कारणले, हामीले सबै आरएनए पुन: प्रयोग गर्न सक्छौं र अझै राम्रो वास्तविक-समय संकेत प्राप्त गर्न पर्याप्त टेम्प्लेटहरू प्रदान गर्न सक्दैनौं?
यस अवस्थामा, पूर्व-प्रवर्धन चरण धेरै उपयोगी हुन सक्छ।
उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन पछि संवेदनशीलता बढाउनको लागि निम्न योजना हो।सुरु गर्नु अघि, हामीले डाउनस्ट्रीमलाई सोध्नु पर्छ कि हामी कुन लक्ष्यहरूमा रुचि राख्छौं, ताकि पूर्व-प्रवर्द्धनका लागि यी लक्ष्यहरूको लागि विशिष्ट प्राइमरहरू डिजाइन गर्न सकिन्छ।
यो 100 जोडी प्राइमरहरू र 10 देखि 14 पटकको प्रतिक्रिया चक्रको साथ मिश्रित प्राइमर सिर्जना गरेर प्राप्त गर्न सकिन्छ।तसर्थ, यस आवश्यकताको लागि विशेष रूपमा डिजाइन गरिएको मास्टर मिक्स प्राप्त सीडीएनएलाई पूर्व-प्रवर्द्धन गर्न आवश्यक छ।
10 र 14 बीचको चक्रहरूको संख्या सेट गर्नुको कारण यो हो कि चक्रहरूको यो सीमित संख्याले विभिन्न लक्ष्यहरू बीच अनियमितता सुनिश्चित गर्दछ, जुन मात्रात्मक आणविक जानकारी चाहिने अनुसन्धानकर्ताहरूको लागि महत्त्वपूर्ण छ।
पूर्व-प्रवर्द्धन पछि, हामीले ठूलो मात्रामा cDNA प्राप्त गर्न सक्छौं, ताकि ब्याक-एन्डमा पत्ता लगाउने संवेदनशीलता धेरै सुधारिएको छ, र हामीले नमूनालाई पातलो गर्न र सम्भावित अनियमित त्रुटिहरू हटाउन धेरै वास्तविक-समय PCR प्रतिक्रियाहरू प्रदर्शन गर्न सक्छौं।
पोस्ट समय: अप्रिल-11-2023